Praktikum im Max-Planck-Institut in Freiburg

Praktikum im Max-Planck-Institut in Freiburg

Wir,Jana Bilanovic und Alexandra Löbker aus dem 12. Jahrgang des Gymnasiums Ulricianum, durften vom 19.10.15-30.10.15 ein Praktikum am Max-Planck-Institut für Immunbiologie und Epigenetik im Labor von Prof. Dr. Thomas Jenuwein in Freiburg absolvieren. Nachdem er im Rahmen der Auricher Wissenschaftstage im vergangenen Februar einen Vortrag über seine Arbeit hielt, wurde dieses Praktikum nun erstmals angeboten.
Da es sich um eine Reise durch ganz Deutschland handelte, begaben wir uns schon am Sonntagvormittag, dem 18.10.15, auf den Weg in den Süden Deutschlands. Gegen Abend erreichten wir dann endlich Freiburg und lernten unseren Betreuer für die zweite Woche Dr. Kevin Daze kennen, der uns die Schlüssel zu unserem Zimmer im Gästehaus des Instituts übergab. Dort begrüßte uns unsere Mitbewohnerin Cecilia aus Brasilien, mit der wir in den nächsten zwei Wochen in einer WG wohnen würden. Sie ist ebenfalls am Institut und wird dort für ihre Doktorarbeit forschen.
Um 10:00 begann am Montag unser erster Tag, der erst einmal dazu diente, unsere beiden Betreuer Dr. Deepika Puri für die erste Woche und Kevin für die zweite etwas besser kennenzulernen und in die Thematik eingewiesen zu werden. Die Atmosphäre war auf Anhieb freundlich und wir stellten fest, dass hier alle geduzt und beim Vornamen genannt werden. Ziemlich schnell wurden wir vor die erste Herausforderung gestellt, da im Labor nur auf Englisch geredet wird und wir Englisch vorher eher nicht im wissenschaftlichen Sinne benutzt hatten. Forscher aus der ganzen Welt arbeiten in diesem Labor, allein unsere Betreuer kommen aus Indien und Kanada und somit waren auch unsere Arbeitsmaterialen alle auf Englisch. Jeder von uns bekam einen eigenen Arbeitsplatz, an dem wir in den folgenden zwei Wochen arbeiten durften. Die Komplexität des Themas erforderte, dass wir den ganzen ersten Tag mit Recherche verbrachten. Unsere Betreuer waren uns eine große Hilfe, da sie jede unserer Unklarheiten bestmöglich beseitigten. Praktische Arbeit war am Montag erst einmal das Betrachten unserer zukünftig zu behandelnden Zellen unter dem Mikroskop und das Auswechseln des Mediums, was ihren Wachstum bewerkstelligt. Bei den Zellen handelt es sich um sogenannte MEFs, die Stammzellen aus Mausembryos sind.
Mittagessen aßen wir gegen 12 Uhr mit dem gesamten Labor in der Mensa, wo wir auch die anderen Forscher aus diesem Labor kennenlernten. Unter anderem waren die Nationalitäten Mexiko, Schweiz, Japan, Polen und die Philippinen vertreten.
Gegen 14 Uhr wurden wir entlassen, damit wir erste Einkäufe erledigen konnten, da wir uns selbst versorgen mussten. Außerdem nutzten wir den Nachmittag auch, um einen ersten Eindruck der wunderschönen Altstadt Freiburgs zu gewinnen. Am Abend lernten wir dann auch unseren zweiten Mitbewohner kennen. Neil, der aus Schottland kommt, war äußert gesprächig und sein starker Akzent bereitete uns anfangs Verständnisschwierigkeiten. Aber wir gewöhnten uns relativ schnell daran, denn auch im Institut trafen wir auf viele verschiedene Akzente.
Am zweiten Tag begann unser erstes Projekt, die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP). Für die Vorbereitung lösten wir erst einmal die Zellen von der Petrischale, da sie sich am Boden abgesetzt hatten, mit einem bestimmten Enzym (Trypsin), wuschen sie und fixierten sie mit Formaldehyd. Dies sollte bewirken, dass alle Vorgänge quasi eingefroren werden.
Erklärend soll man sich die DNA vorstellen, die jeweils in bestimmten Abschnitten um sogenannte Histone gewickelt ist. Die Histone sind große Proteine, die jeweils Schwänzchen haben, die mit Bezeichnungen gekennzeichnet sind. Auf diesen Schwänzchen gibt es viele Positionen, an denen sich chemische Gruppen anlagern können. Diese tragen dann verschiedene Funktionen bei. Die Stelle, die wir untersuchten, war H3K9me3. Dies bedeutet das Schwänzchen H3 an der Position K9 mit einer dreifachen Methylierung. Ist dieses H3K9me3 gegeben, wird das Gen, an welchem es angelagert ist, ein inaktives Gen. Wir wollten dann mithilfe des ChIP die DNA-Abschnitte herausfiltern, die durch H3K9me3 inaktiv sind.
Wir benutzten Wild type (WT)-Zellen und Double null (DN)-Zellen. Der Unterscheid zwischen den Zellen ist, dass die DN ein Enzym (Suv39h1/2) nicht besitzen. Das Enzym ist dafür da, die Reaktion zu katalysieren, die Methylgruppen an die Nukleosome bindet. Also können DN eigentlich keine (dreifache) Methylierung an der Stelle H3K9 besitzen. DN diente uns also als Negativbeispiel.
Für die weiteren Versuche bereiteten wir die Zellen vor, indem wir sie mehrfach wuschen, Stück für Stück öffneten, alles entfernten, was ich zur DNA gehörte und dann letztendlich nur die DNA an sich hatten. Diese wurde durch Schallwellen in kleine Stücke zerschnitten, weil die DNA so erst einmal in der endlos aufgewickelten Form vorlag und damit nicht weiter gearbeitet werden konnte. Da wir für die ChIP eine DNA-Länge von 500 bp (Basenpaare) brauchten, mussten wir erst kontrollieren, ob die Schallwellen die DNA in richtige Stücke geschnitten hatten. Dafür nutzten wir eine sogenannte Agarosegelelektrophorese. Diese eignet sich gut, um die Länge eines DNA-Abschnitts zu bestimmen, denn die stark negativ geladene DNA wird in ein Gel geladen und an einen Stromkreis gekoppelt. Je nach Struktur ist es ihr möglich, mehr oder weniger weit durch das Gel zu „laufen“. Die Stelle an der sich die DNA nach dem Lauf befindet, lässt Aussagen über die Länge des Abschnittes zu: Denn je länger die DNA ist, desto schwerer ist der Weg durch das Gel. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass die Abschnitte alle in der gewünschten Länge vorhanden waren (300-500bp). Danach konnte die eigentliche ChIP beginnen.
Dieses Projekt dauerte die ganze erste Woche über. Zunächst mussten die DNA-Abschnitte gefunden werden, die dieses H3K9me3 besaßen und damit auch mit dem Enzym verbunden waren, da dieses eben diese Methylierung ermöglicht.
Dafür wurde ein spezifischer Antikörper an sogenannte „magnetic Beads“ gebunden. „Magnetic beads“ binden in Zusammenhang mit den spezifischen Antikörpern nur an bestimmte Proteine und bilden dann eine Kette. Diese Kette ist dann magnetisch und kann mit einem Magneten aus der Lösung gezogen werden. Genau das taten wir. Die Antikörper banden nur an unser Protein am H3K9me3 und so konnten wir genau die DNA-Stücke heraus ziehen, die unsere Bedingung erfüllten. Hatten wir diese herausgefiltert, lösten wir die Proteine von den DNA-Abschnitten, weil wir letztendlich nur die DNA-Sequenz brauchten, um zu gucken, welches Gen inaktiviert wurde. Danach führten wir eine Real Time quantitative PCR durch. Diese Methode ist eine Darstellungsweise der Vervielfältigung bestimmter DNA-Abschnitte in Echtzeit. Da die Sequenzen der DNA-Abschnitte mit dem H3K9me3 dem Labor bereits bekannt sind, waren auch die richtigen Primer vorhanden, die für die Vervielfältigung benötigt wurden. So konnten wir am Freitag quasi beobachten, wie sich die DNA-Abschnitte vervielfältigten und durch die Vervielfältigung war uns auch möglich zu bestimmen, wie viel von welchem DNA-Abschnitt in unserer Lösung vorhanden war. Dazu muss noch gesagt werden, dass wir den Farbstoff „SYBR Green I“ benutzten, der als Nachweis doppelsträngiger DNA benutzt wird und Licht nur in einer bestimmten Wellenlänge absorbiert. Diese Absorption wiederum kann von einer Maschine aufgezeichnet werden, weshalb wir dann letztendlich Graphen erhielten, die uns die Menge unserer DNA-Abschnitte zeigten. Mithilfe einer Rechnung konnten wir dann tabellarisch festhalten, wie viel der durch H3K9me3 inaktivierten Gene in den Zellen vorhanden waren. Unsere Ergebnisse deckten sich mit vorausgegangen Versuchsreihen und somit war das Projekt unserer ersten Woche erfolgreich verlaufen.
Neben der Arbeit an unserem Projekt ereignete sich in der ersten Woche auch viel anderes: Jeden Dienstag gibt es im Institut nach dem Mittagessen ein Seminar, bei welchem immer zwei Forscher aus jeweils einem der vielen Labore des Instituts ihre momentane Forschungsarbeit vorstellen. Durch die Komplexität des Themas und Verständnisschwierigkeiten aufgrund der Akzente verstanden wir meist eher wenig. Jedoch erklärte uns Herr Jenuwein freundlicherweise später die Sachverhalte, sodass wir immerhin wussten worum es im großen Ganzen ging. Nach dem Seminar widmeten wir uns unserer Arbeit am Projekt.
Am Dienstagabend saßen wir mit Freunden unserer Mitbewohner beim Abendessen zusammen und wieder war es eine gemischte Gruppe, neben Brasilien und Schottland fanden sich noch Vertreter Taiwans und Belgiens in unserer Wohnung. Der Austausch war äußerst interessant und es gab viel zu lachen. Die beiden Gäste standen ebenfalls vor dem Beginn ihrer Doktorarbeit.
Da jeden Mittwochmorgen zwei Mitglieder des „Jenuweinlabors“ Vorträge halten müssen, fanden wir uns etwas früher als sonst ein. Bei den „Wednesday-Seminars“ wird immer erst über eine aktuelle naturwissenschaftliche Publikation und dann von den eigenen Arbeiten des Vortragenden gesprochen, außerdem werden auch immer warme Croissants gegessen. Den Tag verbrachten wir sonst mit Deepika und der ChIP.
Mittwochnachmittag kochte Cecilia brasilianische Spezialitäten, deren Namen wir nicht mal aussprechen, geschweige denn schreiben können. Lecker waren sie auf jeden Fall.
Am Donnerstag fanden die letzten Schritte der ChIP statt und am Freitag dann die Auswertung. Deshalb entließ Deepika uns auch etwas früher ins ihrer Meinung nach wohlverdiente Wochenende.
Dieses nutzten wir für die Erkundung der Altstadt Freiburgs und auch für einen Tagestrip ins nahegelegene Basel, wo wir diverse Museen und die Innenstadt besichtigten.
Die neue Woche begann dann auch mit unserem anderen Betreuer. Diese Woche war Kevin für uns zuständig, mit ihm standen uns zwei Projekte bevor. Den Anfang machte ein Western Blot. Dies ist eine typische Methode, um herauszufinden, welche Proteine sich in der Zelle befinden. Denn ähnlich wie bei der Agarosegelelektrophorese werden die Bestandteile je nach Länge oder hier dann nach Masse getrennt. Je leichter das Protein ist, desto weiter kann es im Gel laufen. Und so können die Massen der einzelnen Proteine ermittelt werden und die Masse der Proteine lässt Aussagen über die Proteine an sich zu. Wenn dann der Lauf beendet war, konnten die Proteine auf eine Trägermembran übertragen werden. Wenn man diese dann mit zwei Antikörpern versah, wovon der zweite wieder an einen fluoreszierenden Farbstoff gekoppelt war, konnte eine spezielle Maschine die Lichtsignale empfangen, die dann indirekt von den Proteinen auf der Membran ausgingen, und sie auf eine lichtempfindliche Folie übertragen, sodass man letztendlich die Banden der Proteine deutlich auf Folie sieht.
Ab Mittwoch begannen wir dann unser zweites Projekt: die Immunofluoreszenz (IF).
Die Methode der IF wird genutzt, um bestimmte Zellteile für das menschliche Auge mithilfe von Farbe sichtbar zu machen. Wieder benutzten wir WT und DN Zellen, um den Unterscheid zwischen diesen Zellen deutlich aufzeigen zu können. Für die IF würden wir zwei Farbstoffe benutzen, die uns zwei verschiedene Dinge zeigen sollten. Einmal wollten wir die Stellen aufzeigen, wo die DNA sehr eng zusammengepackt war. Diese Teile würden durch den Farbstoff DAPI gezeigt werden und blau aufleuchten. Und zum zweiten wollten wir die Orte nachweisen, die eine Methylierung an der Stelle H3K9 aufwiesen. Für diese Stellen wurde die Farbe Cy5 genutzt, die pink leuchtet.
Da wo die DNA sehr eng zusammen ist, findet keine Vervielfältigung der DNA statt, da dafür der offene Zustand der DNA gebraucht wird. Für diesen geschlossenen Zustand sind H3K9me3 und H3K9me1 zuständig. Somit müssten sich bei Zellen, die das Enzym Suv39h1 besitzen die blau gefärbten Teile mit den pink Gefärbten übereinstimmen.
Zur Vorbereitung versahen wir die Zellen mit spezifischen Antikörpern, die nur an unsere Zielstrukturen banden. An sekundäre Antikörper waren unsere Farbstoffe gekoppelt. Diese banden an die primären Antikörper und wieder entstand eine Kette, die ein fluoreszierendes Ende hatte. Mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops konnten wir dann genau die Wellenlängen des Lichts aussenden, die mit den Farbstoffen übereinstimmten. So sahen wir unter dem speziellen Mikroskop bei beiden Zellen (WT und DN) viele blaue Stellen, wo die DNA also sehr eng zusammen war. Der Unterschied lag dann aber in den pinken Stellen, die nur an H3K9me3/1 banden. Da DN Zellen das Enzym für die Methylierung nicht besitzen, hatten sie auch keine Methylierungen an besagten Stellen, also auch keine linke Färbung an den Stellen der geschlossenen DNA. Diese Geschlossenheit hängt bei DN Zellen also mit anderen Stellen der Histone zusammen, die die Gene inaktivieren. Bei den WT Zellen konnte schön beobachtet werden, dass die pinken mit den blauen Stellen übereinstimmten und die Inaktivierung bestimmter Gene mit der Methylierung an der Stelle H3K9 der Histone zusammenhängt. Auch die zweite Woche war also aus Projekt-Sicht erfolgreich verlaufen.
Ansonsten gestaltete sich die zweite Woche wie folgt: Da eine Forscherin ihren Arbeitsplatz wechselte, verabschiedete sie sich am selben Tag wie wir vom Labor. Mit Kuchen und Eis, die sie für das Labor mitgebracht hatte, ließen wir langsam unser Praktikum ausklingen. Zum Abschluss unseres Praktikums gingen wir auf die Halloweenparty vom Institut, die an unserem letzten Abend stattfand. Auf dieser waren auch ein paar Forscher aus dem Jenuweinlabor gekommen unter anderem auch unser Betreuer Kevin, sowie unsere Mitbewohner Neil und Cecilia. Auch wenn der gut gelungene Abschluss amüsant und heiter war, mussten wir früh gehen, um zu packen, da wir uns am nächsten Tag leider sehr zeitig auf die Reise nach Hause in den Norden machen mussten.
Alles in allem war es ein unglaublich interessantes und lehrreiches Praktikum, das uns wissenschaftlich definitiv weiter gebracht hat. Es hat uns viele neue Bekanntschaften beschert sowie wundervolle Austausche mit Menschen aus der ganzen Welt ermöglicht. Das Jenuwein-Labor stand uns durchgehend helfend zur Seite und hat alle unsere Fragen bestmöglich beantwortet und geholfen, wo immer wir Hilfe benötigten, dafür möchten wir uns herzlich bedanken.
Außerdem möchten wir uns natürlich und vor allem bei den Auricher Wissenschaftstagen und den dafür zuständigen Lehrkräften sowie bei Herrn Jenuwein für die Ermöglichung dieser tollen zwei Wochen bedanken.